Buts de l’anatomie pathologique dans la pratique médicale

Le rôle de l’anatomocytopathologie est de contribuer à :

Prélèvements cytologiques

Les cellules isolées, ou les petits amas cellulaires, peuvent être obtenus de diverses façons :

Prélèvements tissulaires

Ils sont effectués selon trois modalités : la biopsie, les pièces opératoires et l’autopsie.

Biopsie

La biopsie consiste à prélever un fragment de tissu sur un être vivant en vue d’un examen anatomopathologique. Par extension, ce terme peut désigner le fragment tissulaire.

La biopsie peut être effectuée selon plusieurs modalités :

• par ponction à l’aide d’une aiguille coupante ou d’un trocart (foie, rein, os, etc.) : on obtient des cylindres de tissu de quelques millimètres à quelques centimètres de long (figure 1.1). Les ponctions sont effectuées « à l’aveugle » lorsque l’ensemble de l’organe est malade, ou sous repérage (échographie, scanner) lorsque la ponction doit être dirigée sur une lésion focale visible en imagerie ;

• par biopsie chirurgicale après anesthésie locale ou générale et sous contrôle de la vue : biopsie partielle, ou biopsie exérèse enlevant la totalité de la lésion ;

• au cours d’une endoscopie (pince montée sur l’endoscope) : fragments de 0,5 mm à 2 mm (figure 1.2).

Figure 1.1 Carotte de ponction-biopsie hépatique. À gauche, vue macroscopique de la lame : deux carottes de 1 cm. À droite, vue microscopique d’une carotte colorée (* 50).

Figure 1.2 Biopsie de muqueuse colique prélevée à la pince lors d’une endoscopie. À gauche, vue macroscopique de la lame : elle présente 3 biopsies de 1 à 2 mm de diamètre, sur quatre coupes. À droite, vue microscopique d’une biopsie colorée (* 50).

La valeur des biopsies repose sur :

1. leur taille (ex : pour la recherche d’une artérite de Horton où les lésions sont segmentaires, une biopsie d’artère temporale représentative doit mesurer au moins 1,5 cm) ;

2. leur nombre : plus elles sont nombreuses, plus on a de chance de trouver du tissu tumoral, de rendre compte de l’hétérogénéité d’une tumeur et d’observer une lésion focale, mais importante pour le diagnostic ;

3. le choix de la zone biopsiée : éviter les zones nécrotiques ou hémorragiques ; sur la peau ou une muqueuse, éviter les prélèvements trop superficiels ; biopsier le ganglion ayant fait l’objet d’une ponction cytologique motivant la biopsie ;

4. la bonne préservation des tissus : ne pas étirer ou écraser les fragments, éviter le bistouri électrique « grillant » les tissus ;

5. le repérage topographique de biopsies multiples (flacons différents répertoriés).

Pièces opératoires

Les pièces opératoires : exérèse partielle ou complète d’un ou de plusieurs organes, séparés ou en monobloc (figure 1.3).

Figure 1.3 Pièce opératoire : pièce d’œsogastrectomie pour cancer du bas œsophage (flèche). A. Pièce fraîche. B. Pièce après fixation dans une solution de formol.

Enregistrement

Lorsqu’un prélèvement parvient au laboratoire, il est enregistré et reçoit un numéro d’identification unique. Celui-ci sera retranscrit sur les blocs et les lames, qui seront examinées au microscope après le traitement technique du prélèvement. Chaque prélèvement doit être accompagné d’une fiche de renseignements remplie par le médecin prescripteur qui doit mentionner :

Techniques d’étude des cellules

Étalement des cellules sur des lames de verre

L’étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d’organes, des frottis, écouvillonnage, brossages ou appositions. Ce geste simple doit être bien maîtrisé pour éviter un écrasement des cellules, ou des amas, en plusieurs couches peu interprétables (figure 1.4).

Figure 1.4 Ponction cytologique. À gauche : projection du produit de ponction à l’aiguille sur une lame. Au centre : la goutte est étalée, tirée à l’aide d’une autre lame. À droite : lame d’un étalement cytologique après coloration.

Cytocentrifugation sur lame de verre

Le liquide (naturel, ou d’épanchement, ou de lavage) est acheminé au laboratoire où il est centrifugé directement sur une lame de verre, sous forme de pastille (figure 1.5).

Figure 1.5 Cytocentrifugation d’un liquide d’ascite. À gauche : cytocentrifugeuse. À droite : spot de cytocentrifugation sur lame après coloration.

Fixation des étalements

Elle se fait soit par simple séchage à l’air pour la coloration de May-Grünwald-Giemsa (figure 1.6), soit par immersion dans l’alcool-éther, ou par application d’un aérosol de laque fixante pour les colorations de Harris-Schorr, ou de Papanicolaou (frottis cervico-utérins notamment [figure 1.7]).

Figure 1.6 Produit de cytoponction d’un ganglion lymphatique de lymphome de Hodgkin ; étalement coloré au May-Grünwald-Giemsa.

Figure 1.7 Frottis cervico-utérin : étalement coloré au Papanicolaou.

Afin d’éviter l’altération des cellules par autolyse, la fixation, la cytocentrifugation et la coloration doivent être effectuées rapidement après l’obtention du prélèvement :

• fixation des frottis cervico-utérins par le médecin préleveur ;

• acheminement rapide d’un liquide à l’état frais au laboratoire ;

• et coloration au MGG sans délai excessif de lames séchées à l’air.

En cas de besoin (par exemple, recueil d’un liquide en dehors des heures d’ouverture d’un laboratoire) un liquide peut être provisoirement stocké dans un réfrigérateur à + 4 °C.

Techniques d’étude des tissus

La technique de base comporte plusieurs étapes : la fixation, l’inclusion en paraffine, la confection de coupes et leur coloration. Avant la fixation, il est possible d’effectuer sur le tissu frais des appositions sur lames pour une étude cytopathologique, et des prélèvements pour des techniques particulières :

En ce qui concerne les pièces opératoires, une étape d’analyse macroscopique est indispensable, avant (idéalement) ou après la fixation de la pièce.

Étude macroscopique

L’examen macroscopique détaillé est une partie essentielle de l’étude d’une pièce opératoire : la pièce est examinée, mesurée, pesée, palpée puis disséquée (figure 1.8). Chaque lésion est repérée sur un schéma et éventuellement photographiée. Ces constatations sont confrontées aux documents cliniques et/ou radiologiques, ce qui souligne l’importance des renseignements écrits fournis par le médecin clinicien. En cas de pièces opératoires complexes (exérèse monobloc de plusieurs organes, ou pièce de résection selon une méthode non conventionnelle), le chirurgien devra adresser la pièce avec des indications de repérage topographique. Il peut être utile de marquer les berges d’une pièce de résection de tumeur avec une encre indélébile : ceci ne nuit pas à l’étude histologique et permet d’apprécier exactement la distance entre la tumeur et la limite chirurgicale de la pièce (figure 1.9).

Figure 1.8 Examen macroscopique d’une pièce opératoire : mesure et dissection d’une pièce d’œsogastrectomie fixée dans le formol puis sélection des prélèvements destinés à l’étude microscopique.

Figure 1.9 Pièce d’exérèse de prostate et de vésicules séminales. A. Surface tatouée à l’encre de chine. B. Tranche de section de la prostate : l’encre ne pénètre pas en profondeur. En bas lors de l’examen microscopique, l’encre permet de repérer exactement les limites de la résection chirurgicale (limite noire à gauche).

L’examen macroscopique donne des indications pour le pronostic de la maladie (notamment la taille et la localisation d’un cancer) et il permet de sélectionner les territoires à prélever pour l’étude microscopique : zones lésées, zones d’aspect macroscopique sain et limites d’exérèse.

Après le choix des prélèvements destinés à l’analyse microscopique, les restes de la pièce opératoire sont conservés pendant quelques jours ou semaines afin de pouvoir en cas de nécessité effectuer des prélèvements complémentaires.

Imprégnation et inclusion

Les prélèvements ayant achevé leur fixation sont déposés dans des cassettes en plastique, directement s’il s’agit de biopsies ou, s’il s’agit de pièces opératoires, après l’étape d’examen macroscopique au cours de laquelle sont prélevés des fragments de petite taille (en moyenne 2 × 0,3 cm). Puis les tissus contenus dans les cassettes sont déshydratés par passage dans des alcools, l’alcool est éliminé par des solvants (xylène), puis la paraffine liquide à 56 °C imprègne les tissus et est refroidie. Ces étapes sont automatisées dans des appareils à inclusion. L’étape finale de l’inclusion est manuelle et consiste à réorienter convenablement le fragment tissulaire dans le sens de la coupe dans un moule de paraffine (figure 1.10).

Figure 1.10 Inclusion manuelle du tissu dans un moule de paraffine. En haut : orientation des prélèvements dans la paraffine liquide. En bas : refroidissement de la paraffine.

Coupes et colorations

Le bloc solide de paraffine contenant le tissu est coupé grâce à un microtome, les coupes de 3 à 5 microns d’épaisseur sont étalées sur des lames (figure 1.11). Après dissolution de la paraffine, puis réhydratation, le tissu est coloré. La coloration usuelle associe un colorant basique nucléaire (hématéine, hématoxyline) et un colorant acide cytoplasmique (éosine, érythrosine, ou phloxine). On y ajoute souvent du safran qui se fixe sur le collagène (figure 1.12). La coupe colorée est protégée par une lamelle de verre collée, ou par un film plastique transparent (figure 1.13). Elle est alors prête à être analysée au microscope par un médecin anatomopathologiste.

Figure 1.11 Technique histologique : étapes manuelles. En haut : coupe au microtome. En bas : étalement.

Figure 1.12 Coloration hématoxyline-éosine-safran d’une muqueuse de trompe utérine : les cytoplasmes sont roses, les noyaux bleutés, le collagène jaune.

Figure 1.13 Coupe du tissu étalé sur lame et coloré en hématoxyline-éosine-safran (B). En bas : tissu inclus en paraffine dans le bloc correspondant (A).

Examen histologique extemporané

Il s’agit d’un examen anatomopathologique pratiqué dès que le prélèvement est effectué, non fixé, pendant une intervention chirurgicale, afin de fournir rapidement au chirurgien un diagnostic susceptible de modifier le déroulement de l’acte chirurgical.

Les motifs les plus fréquents de demandes d’examens histologiques extemporanés sont :

La technique utilise la macroscopie et, le plus souvent, des coupes au cryomicrotome (cryostat) et une coloration rapide, ce qui permet un résultat en moins de 30 min (figure 1.14).

Figure 1.14 Examen histologique extemporané. A. Étude macroscopique du prélèvement frais. B. Un fragment est prélevé et fixé sur un portoir. C. Le fragment congelé est coupé dans un cryostat. D. Coupe de tissu congelé colorée au bleu de toluidine.

Cependant au cours d’un examen extemporané, la morphologie tissulaire n’est pas d’aussi bonne qualité qu’après une fixation et inclusion en paraffine, en raison de la congélation qui altère la morphologie cellulaire. En outre, pour respecter un délai de réponse court, il n’est pas possible d’examiner en totalité une lésion volumineuse. Le diagnostic fourni par un examen extemporané n’est donc pas aussi fiable qu’un diagnostic histologique conventionnel : il ne doit être considéré que comme un diagnostic de présomption.

Les tissus calcifiés ne peuvent être coupés dans un cryostat et ne peuvent donc pas faire l’objet d’un examen histologique extemporané.

Colorations histochimiques spéciales

Des colorations spéciales ont pour but de mettre en évidence des constituants particuliers des cellules (glycogène, mucus, pigments, etc.), ou de la matrice extra-cellulaire (collagènes, fibres élastiques, amylose, etc.), ainsi que des agents infectieux (bactéries, parasites, champignons). Ces colorations sont très variées (tableau 1.1) et leur mise en œuvre rallonge le processus technique (figures 1.15–1.25).

Tableau 1.1 Liste des colorations histochimiques les plus courantes.

Figure 1.15 Coloration de PAS-bleu Alcian sur les cellules caliciformes mucisécrétantes de la muqueuse intestinale.

Figure 1.16 Coloration de rouge Congo d’une amylose glomérulaire (lumière non polarisée).

Figure 1.17 Coloration de rouge Congo d’une amylose glomérulaire : aspect dichroïque vert-jaune des dépôts amyloïdes en lumière polarisée.

Figure 1.18 Coloration de Perls : surcharge hémosidérinique dans des hépatocytes (granules bleus).

Figure 1.19 Coloration de Fontana-Masson sur un nævus nævocellulaire cutané : mélanocytes chargés de mélanine (noire) autour d’une glande sébacée.

Figure 1.20 Coloration de trichrome de Masson au bleu d’aniline sur tissu hépatique ; coloration bleue du collagène d’un espace porte.

Figure 1.21 Coloration au rouge Sirius : nodules hépatiques hyperplasiques régénératifs.

Figure 1.22 Coloration de Gomori des fibres élastiques (flèches) d’une artère temporale.

Figure 1.23 Coloration de Weigert des fibres élastiques d’une artère temporale.

Figure 1.24 Coloration de Grocott d’un filament fungique (aspergillus).

Figure 1.25 Coloration de Whartin-Starry : bactéries du genre Hélicobacter Pylori dans une crypte gastrique, colorées en noir.

Histoenzymologie

Certains enzymes peuvent être mis en évidence sur des coupes congelées ou parfois après inclusion dans la paraffine. La coupe est incubée dans un substrat spécifique de l’activité enzymatique recherchée. La réaction libère un produit coloré, ou colorable, qui peut être visualisé au microscope optique. L’application la plus courante est l’étude des biopsies musculaires pour myopathies.

Immunohistochimie

L’immunohistochimie consiste à mettre en évidence divers antigènes (Ag) cellulaires, ou extra-cellulaires, grâce à des anticorps (Ac) spécifiquement dirigés contre eux, sur des préparations cytologiques (immunocytochimie), ou sur des coupes de tissus congelés, ou fixés, et inclus en paraffine. Les Ag recherchés peuvent être des Ag membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires, ou des protéines de la matrice extra-cellulaire.

L’immunofluorescence directe est surtout utilisée pour mettre en évidence les dépôts tissulaires d’immunoglobulines et de complément dans les biopsies cutanées et dans les biopsies rénales congelées, observées grâce à un microscope à fluorescence (figure 1.26).

Figure 1.26 Immunofluorescence sur une biopsie rénale congelée : mise en évidence de dépôts anormaux de chaînes légères kappa dans les membranes basales des tubes (maladie des dépôts de chaînes légères d’immunoglobulines).

Dans les méthodes immunoenzymatiques indirectes, l’Ac spécifique primaire est déposé sur le tissu, puis il est révélé par un 2^e Ac couplé à une enzyme à laquelle on fournit son substrat. Le produit coloré de la réaction enzymatique apparaît au niveau du site des complexes Ag-Ac (figure 1.27).

Figure 1.27 Mise en évidence immunohistochimique de l’insuline dans un îlot de Langerhans (technique d’immunoperoxydase sur tissu pancréatique fixé et déparaffiné).

L’intensité du signal obtenu après marquage d’une réaction antigène-anticorps dépend du nombre de molécules colorées visibles. Plusieurs mécanismes d’amplification sont possibles, parmi lesquels les méthodes à trois couches, ou l’utilisation de polymères portant plusieurs molécules d’anticorps. L’augmentation du temps d’incubation et le prétraitement des coupes déparaffinées par la chaleur ou des enzymes augmentent aussi l’intensité du signal.

L’immunohistochimie est très largement utilisée avec de multiples indications parmi lesquelles :

Techniques de biologie moléculaire in situ

Mise en évidence sur des coupes tissulaires (en congélation, ou après inclusion dans la paraffine), ou sur des étalements cellulaires, de séquences d’ARN ou d’ADN grâce à des sondes d’acides nucléiques complémentaires et couplées à un traceur radioactif (sondes chaudes), ou à une enzyme (sondes froides), ou un fluorochrome (sondes fluorescentes). Le terme in situ indique que la détection s’effectue au sein du chromosome en configuration native, à la différence des techniques d’étude d’acides nucléiques extraits sur gels.

L’hybridation in situ classique a relativement peu d’indications car un grand nombre de copies de l’acide nucléique doit être présent dans la cellule pour qu’une réaction positive soit obtenue. Elle peut être utilisée pour mettre en évidence des acides nucléiques viraux (HPV, EBV), ou des ARN de chaînes légères d’immunoglobulines.

L’hybridation in situ fluorescente (FISH) ou l’hybridation in situ chromogénique (CISH) peuvent se faire sur des suspensions cellulaires, des empreintes, ou des coupes congelées ou déparaffinées, et permettent d’identifier dans chaque cellule la présence et le nombre de copies d’un segment chromosomique donné et, en utilisant des fluorochromes différents, d’apprécier une éventuelle co-localisation. Elles sont de plus en plus utilisées pour rechercher des anomalies chromosomiques variées (polysomies, monosomies), ou géniques (délétions ou amplifications de certains gènes, translocations), anomalies qui peuvent avoir dans certaines tumeurs une valeur diagnostique ou pronostique.

Techniques de biologie moléculaire

L’analyse morphologique des prélèvements cellulaires et tissulaires peut être complétée par des analyses utilisant des techniques non morphologiques de biologie moléculaire (recherche de clonalité, de perte d’hétérozygotie, de mutations, de réarrangements, etc.). Ces techniques sont réalisées soit au sein des laboratoires de pathologie, soit dans des départements de biologie moléculaire en relation étroite avec des pathologistes. Toutes ces analyses (sur cellules isolées, tissu frais, congelé ou fixé) doivent impérativement être effectuées après un contrôle morphologique du prélèvement analysé. Si le prélèvement est très hétérogène, ou si les cellules pathologiques sont rares, il est parfois nécessaire de le microdisséquer. Pour un patient donné, les résultats de ces techniques vont participer à l’établissement du diagnostic, à l’évaluation du pronostic ou permettre de guider les décisions de prise en charge thérapeutique.

Microscopie électronique

Cette technique, par l’utilisation de coupes tissulaires très fines (moins de 100 nm) et de grandissements très importants, permet une étude à l’échelon cellulaire (analyse des constituants d’une cellule, des jonctions intercellulaires, d’éventuels dépôts, inclusion etc.). Les prélèvements doivent être de petite taille (2 à 3 mm), des fixateurs spéciaux doivent être utilisés (glutaraldéhyde, puis acide osmique le plus souvent) avant l’inclusion dans une résine. Des techniques d’immunohistochimie peuvent être adaptées au microscope électronique (notamment par des systèmes de révélation utilisant des billes d’or colloïdal denses aux électrons).

L’utilisation du microscope électronique à visée diagnostique est actuellement très réduite (pathologies rares neuromusculaires, rénales ou de surcharge) et elle a été supplantée par l’immunohistochimie, qui permet d’obtenir des résultats plus précis, beaucoup plus rapidement et à moindre coût.

Histomorphométrie

Cette technique permet une évaluation quantitative de certains paramètres : étude de la masse osseuse, quantification de la quantité de tissu conjonctif fibreux, étude de caractères morphologiques cellulaires (taille des noyaux), quantification de résultats immuno-histochimiques. Elle utilise des appareils semi-automatiques couplés à des ordinateurs.

Microscopie confocale à balayage laser

Le microscope confocal à balayage laser est un microscope à fluorescence dont le faisceau lumineux est généré par un laser. Les signaux transmis sont captés, numérisés et un logiciel permet de reconstituer les images. Le microscope confocal permet une analyse morpho-fonctionnelle des cellules et des tissus, par la quantification des intensités des marquages fluorescents et la détection de leur localisation, ou co-localisation précise au sein des constituants cellulaires.

Lames virtuelles

Ce sont des reproductions numériques d’une lame, obtenues par la juxtaposition de très nombreuses images, acquises automatiquement et successivement, à fort grandissement. Ces images numériques peuvent ensuite être facilement consultées par plusieurs pathologistes. C’est une technologie très utile pour l’enseignement, la relecture de cas lors de protocoles thérapeutiques ou en assurance qualité pour l’analyse de la reproductibilité diagnostique.

Cytométrie en flux

C’est l’étude des cellules en suspension entraînées dans un flux et interceptées par un faisceau lumineux émis par un laser. Le faisceau modifié est détecté, amplifié et converti en signaux électriques traités par un ordinateur. Les suspensions cellulaires peuvent provenir de liquides naturels ou d’épanchements pathologiques, du broyage de tissu frais ou congelé ou de la dissociation enzymatique de coupes épaisses (70–100 μm) de blocs de paraffine. L’analyse directe des constituants de la cellule permet de déterminer des paramètres à valeur pronostique en cancérologie : phase S, ploïdie. Des populations cellulaires peuvent être étudiées après incubation avec des Ac spécifiques couplés à un fluorochrome : une application possible est la détermination des antigènes membranaires caractéristiques des sous-populations cellulaires, normales ou tumorales dans le sang, la moelle osseuse, ou dans une suspension cellulaire issue d’un ganglion lymphatique.

PCR in situ

Elle combine, sur des coupes histologiques, une amplification de type PCR et une hybridation in situ. Cette technique, très sensible, est d’un maniement difficile, qui empêche encore actuellement son utilisation en routine.

Microdissection

Elle permet de réaliser des analyses moléculaires ciblées. Elle est notamment utilisée lorsque le prélèvement est très hétérogène, pour ne prélever sur une lame que les territoires ou les cellules que l’on souhaite analyser. Cette microdissection peut être soit manuelle, soit par faisceau laser.

Bloc de tissue microarrays et les techniques non morphologiques

Le bloc de tissue microarrays est un bloc de paraffine comportant des carottes de 0,6 à 4 mm de diamètre, alignées dans un ordre, repéré dans un bloc receveur (figure 1.28). Ces blocs, comportant de nombreuses tumeurs, permettent de valider facilement de nouveaux marqueurs.

Figure 1.28 Bloc de tissue microarray (en bas, à gauche) à partir duquel sont réalisées une coloration HE et une étude immunohistochimique avec des anticorps anti-KIT et anti-CD34 (à droite).

L’analyse de la signature moléculaire d’une lésion, fondée sur l’étude du transcriptome (étude à grande échelle des ARN extraits des tissus par biopuces ou PCR quantitative) est facilitée par les puces à ADN et le développement de puces dédiées avec un nombre restreint de gènes.

L’analyse du protéome avec des appareils de spectrométrie de masse de type SELDI-TOF (surface enhanced laser desorption/ionization time of flight) se développe, avec pour principe de séparer les protéines par leurs propriétés chimiques et leur masse moléculaire avant d’analyser les protéines d’intérêt.